оборудование для разведения перепелов

Перепелка

Перепёлка.org.ua

О ферме ~ Купить перепёлок, яйцо, клетку ~ Разведение ~ Инкубаторий ~ Бизнес ~ Мастерская ~ Поиск по сайту

Поиск по сайту


Коршунова Л. Г. "Трансгенез у перепелов"


Коршунова Трансгенез у перепеловВыдержки из автореферата диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, Москва, 2012


1. Общая характеристика работы
2. Материал и методы исследований

3. Результаты исследований
Выводы
Сведения о практическом использовании результатов исследований
Рекомендации по использованию научных выводов
Список работ, опубликованных по теме диссертации



3. Результаты исследований

Получение и фенотип трансгенных перепелов по гену гормона роста быка

Перепела, трансгенные по гену гормона роста быка, были получены хирургическим методом микроинъекции экзогенной ДНК перепелиных яйцеклеток, как овулировавших, так и находившихся на поздних стадиях созревания (крупные фолликулы). Для инъекции использовали генную конструкцию pMTbGH(2*att), содержащую природный ген гормона роста быка (bGH gene), находящийся под контролем металлотионинового промотора (MT prom) (рис. 1). Последний активируется ионами цинка и других тяжелых металлов, содержащихся в организме птицы. Активный промотор заставляет экспрессироваться ген бычьего гормона роста. У трансгенных по этой конструкции перепелов происходит синтез указанного гормона.
 

Физическая карта плазмиды pMTbGH(2*att) (указаны сайты рестрикции эндонуклеазами), использованной в качестве генной конструкции при получении генетически модифицированных перепелов

Рисунок 1. Физическая карта плазмиды pMTbGH(2*att) (указаны сайты рестрикции эндонуклеазами), использованной в качестве генной конструкции при получении генетически модифицированных перепелов


Было прооперировано 93 перепелки, у которых инъецировано 280 яйцеклеток, как овулировавших, так и находившихся в крупных фолликулах. От них получено 122 перепеленка.

Методами блот-гибридизационного анализа и ПЦР было исследовано 180 проб ДНК, выделенных из эмбрионов, органов и тканей экспериментальных перепелов. Нуклеотидные последовательности гена гормона роста быка были обнаружены в ДНК 10 эмбрионов и 14 особей перепелов. Распределение трансгена в тканях опытных перепелов проиллюстрировано на рис. 2.

Трансгенные перепела были исследованы на содержание в крови бычьего соматотропина. В некоторых образцах крови он был обнаружен в количестве 1,0-3,0 нг/мл. Таким образом, экспрессия трансгена в крови полученных трансгенных перепелов составила от 1,0 до 3,0 нг/мл бычьего соматотропина, тогда как в крови перепелов контрольной группы искомый белок отсутствовал. Трансгенность перепелов проявилась в ряду поколений.
 

Блот-гибридизационный анализ ДНК из различных тканей перепелов

Рисунок 2. Блот-гибридизационный анализ ДНК из различных тканей перепелов: 1 - птица 116, грудная мышца; 2 - птица 116, печень; 3 - птица 116, ножная мышца; 4 - птица 22, миокард; 5 - птица 22, грудная мышца; 6 - птица 107, грудная мышца; 7 - птица 107, миокард; 8 - кровь контрольного перепела плюс плазмида в количестве 1-2 копии на гаплоидный геном


В процессе выращивания экспериментально полученных перепелов и отвода от них потомства было замечено, что некоторые самки сносили крупные яйца (14,0-21,0 г), а из яиц с обычной массой вылуплялись перепелята с живой массой на 15-25% выше обычной. Вскрытие показало, что яйца не были двухжелтковыми и были покрыты нормально пигментированной прочной скорлупой. Была установлена связь признака «крупнояичности» с трансгенностью особей, а также наследование этого признака (рис. 3).
 

Пример фенотипического проявления трансгенности в потомстве перепелов

Рисунок 3. Пример фенотипического проявления трансгенности в потомстве перепелов


Это послужило основанием для размножения экспериментальных особей и изучения фенотипа полученной птицы. Трансгенные особи были использованы с целью получения потомства для формирования и дальнейшего исследования опытной группы перепелов. В настоящее время получено и изучено 33 поколения экспериментальных перепелов.

У трансгенных перепелов живая масса на 5-15% была выше, чем в контроле. У их потомков сохранялось превосходство по живой массе (рис. 4), причем у самок различия оказались более существенны. В суточном и 1-недельном возрасте опытные птицы были крупнее контрольных соответственно на 21 и 13%. Средняя масса суточных перепелят в опытной группе составляла 9,1, в контрольной - 7,4 г. В 7- и 20-недельном возрасте статистически достоверные различия наблюдались только у самок - соответственно 8,0 и 6,0% (p<0,001).

Масса суточного молодняка птицы в значительной степени обусловлена массой инкубационных яиц. В наших опытах с увеличением массы яиц пропорционально увеличивалась масса трансгенных суточных перепелят (r = +0,810). При этом все перепелята были подвижными, активно реагировали на звук, имели мягкий подобранный живот, чистую клоаку. Пух мягкий, ровный, блестящий, правильно пигментированный (коричневого цвета с двумя светлыми полосками на спинке). Ноги и клюв крепкие, глаза блестящие. Взрослые особи внешне не отличались от контрольных перепелов.
 

Живая масса перепелов опытной и контрольной групп, в среднем по 15 поколениям

Рисунок 4. Живая масса перепелов опытной и контрольной групп, в среднем по 15 поколениям


Живая масса трансгенных перепелов варьировала от поколения к поколению, однако, линия тренда для этого показателя в 20-недельном возрасте свидетельствовала об отсутствии тенденции к снижению (наклон незначительный, R2 = 0,019) (рис. 5).
 

Живая масса самок перепелов в возрасте 20 нед, трансгенных по гену бычьего соматотропина, в разных поколениях.

Рисунок 5. Живая масса самок перепелов в возрасте 20 нед, трансгенных по гену бычьего соматотропина, в разных поколениях.


Гормональный статус трансгенных перепелов по изученным показателям не претерпел существенных изменений по сравнению с контрольными. Среднее значение уровня инсулина у самок опытной группы составило 15,8 и у самцов -16,4 против 10,7 и 16,5 мкЕд/мл соответственно у контрольной группы. Индивидуальные значения этого показателя варьировали у опытной группы от 6,7 до 30,9 и у контрольной - от 7,8 до 18,1 мкЕд/мл.

В значениях показателей содержания тиреоидных гормонов в крови перепелов опытной и контрольной групп наблюдался большой разброс. Так, минимальные концентрации тироксина составляли 12 нМ, максимальные: 10-12 нМ. Средние значения составили у опытных самок 4,2 и у самцов 6,1 нМ, тогда как у контрольных соответственно 4,7 и 5,7 нМ. Концентрация трийодтиронина у опытных самок была 0,7 и у самцов 1,6 нМ, у контрольных соответственно 0,8 и 1,6 нМ. Значительные колебания концентрации трийодтиро-нина были более характерны для самок - от 0,2 до 2,1 нМ, в то время как у самцов - от 1,2 до 2,1 нМ.

Показатель отношения концентрации инсулина к трийодтиронину, по которому можно судить о сдвиге метаболизма в организме, был выше у самок, чем у самцов, а также у самок опытной группы по сравнению с контрольной, что подтверждает более высокий уровень анаболизма у подопытных самок, выраженный в повышенном синтезе компонентов яйца.

Полученные данные по нарастанию титров антител в крови и желтке яиц в ответ на введение антигена свидетельствуют о повышении иммунного статуса у перепелов опытной группы, выраженным в ускоренной выработке антител к вводимому антигену. Через четыре недели титры антител у опытных перепелов были выше (p<0,001), чем в контроле (табл. 1). Достоверные различия были получены и для экстрактов желтков яиц контрольной и опытной групп, снесенных через 4 недели после вакцинации (p<0,001).
 

Показатели поствакцинального иммунитета перепелов


У трансгенных перепелов и их потомков масса яиц была на 10-20% выше, чем в контроле (p<0,001). На пике продуктивности масса яиц у опытных перепелов в среднем по 33 поколениям составила 13,0 г. Разброс показателя по отдельным особям был от 11,3 до 15,0 г.

Яйценоскость перепелок в опытной группе в поколениях колебалась от 200 до 235 яиц, в контроле - от 193 до 227 яиц за 10 месяцев продуктивного периода. Средняя яйцемасса за этот период в опытной группе составила 2749,4 г, что на 11% больше, чем в контрольной группе (p<0,001). Средняя число яиц и их масса по поколениям представлены на диаграмме (рис. 6).
 

Число (1, 2) и масса (3, 4) яиц в среднем по 19–33 поколениям,

Рисунок 6. Число (1, 2) и масса (3, 4) яиц в среднем по 19-33 поколениям, 1, 3 - трансгенная, 2, 4 - интактная птица


В опытной и контрольной группе увеличение массы яйца до 14,0 г было обусловлено пропорциональным увеличением массы его составных частей - скорлупы, белка, желтка. При этом доля желтка составила 29-33%, белка - 58-61%, скорлупы - 9-10%. Начиная с массы яиц выше 14 г в опытной группе, соотношение составных частей изменилось. Доля желтка возросла до 39,6%, белка - снизилась до 52,3% и скорлупы - до 8,1%. Индекс формы яиц массой от 8,0 до 14,0 г в контрольной и опытной группах варьировал в пределах 75,483,6%. При дальнейшем увеличении массы яиц в опытной группе происходило снижение индекса формы до 67,5%, то есть форма становилась более вытянутой.

Большая часть сухих веществ желтка перепелиных яиц приходится на долю липидов. В желтке яиц опытной группы их содержалось от 26,1 до 29,3%, контрольной - 27,8-29,2%.

Содержание протеинов составило от 15,1 до 17,0% для всех проанализированных желтков, независимо от их массы и принадлежности к группе. Не установлено в обеих группах закономерных различий и по содержанию воды в желтках яиц разной массы.

Белок перепелиных яиц содержал 85,0-87,9% воды. На долю протеинов приходилось от 8,9 до 10,9%. Закономерные различия между группами также отсутствовали.

Содержание каротиноидов в желтке яиц опытной группы было от 9,2 до 16,6 мкг/г, в контрольной - от 12,2 до 20,7 мкг/г. Отмечена тенденция повышения содержания каротиноидов с увеличением массы яйца. Содержание витамина А в желтке яиц опытной группы менялось от 12,8 до 16,8 мкг/г, в контрольной - от 14,2 до 19,7 мкг/г. Содержание витамина Е в желтке яиц опытной группы варьировало в пределах 56,7-80,5 мкг/г, в контрольной - от 75,4 до 90,5 мкг/г. Витамина В2 в желтке яиц опытной группы содержалось 3,68-4,10 мкг/г, контрольной - 3,82-4,42 мкг/г и не зависело от массы яиц. Витамин В2 в белке яиц опытной группы находилось в пределах 1,681,91 мкг/г, контрольной - 1,95-2,16 мкг/г. Аминокислотный состав яичного белка трансгенных перепелок не отличался от такового у контрольных особей.

В желтках яиц у контрольных перепелок на долю насыщенных жирных кислот приходилось 41,35, мононенасыщенных - 41,06, полиненасыщенных - 17,59%. Сумма насыщенных и полин енасыщен-ных жирных кислот в липидах желтка у птиц в опытной группе была несколько больше и составляла соответственно 42,08 и 19,41%, сумма мононенасыщенных жирных кислот была меньше, чем в контрольной - 38,51%. Выявленные различия обусловлены в основном увеличением содержания стеариновой и линолевой кислот на 1,8% и уменьшением количества олеиновой кислоты на 2,3% в яйцах у перепелок из опытной группы. При этом массовая доля олеиновой кислоты изменялась от 31,40 до 37,00%, линолевой - от 19,90 до 17,30%. В опытной группе содержание стеариновой кислоты в яйцах у несушек 3- и 6-месячного возраста было соответственно 17,03 и 16,76%, линолевой кислоты - 18,08 и 19,33%. Доля олеиновой кислоты в яйцах несушек из опытной группы оказалась 38,55 и 33,59% соответственно. Следовательно, при изменении массы яйца и в опытной, и контрольной группах перепелок наблюдались колебания в содержании отдельных жирных кислот в липидах желтка. Главным образом это относилось к жирным кислотам с 18 атомами углерода: стеариновой, олеиновой, линолевой и линоленовой.

Таким образом, в наших исследованиях экспериментально показано, что у полученных трансгенных по гену гормона роста быка перепелов произошло усиление биосинтетических процессов в организме без изменений в биологических закономерностях, определяющих процессы роста и развития птицы, формирования яйца. Полученные данные свидетельствуют о возможном практическом использовании методов трансгенеза в селекционной работе на повышение продуктивных показателей птицы.


Перепелиные яйца




Статья была Вам интересна? Подпишитесь на рассылку “Перепёлка.org.ua - новости перепеловодства” и Вы всегда будете в курсе инноваций в мире перепелов. Подписаться >>



Вы можете высказать своё мнение по данному материалу или задать вопрос. Администратор сайта ежедневно просматривает комментарии и отвечает на вопросы.


Данную страницу никто не комментировал. Вы можете стать первым.

Ваше имя:
Ваша почта:

Комментарий:
Введите символы: *
captcha
Обновить