Коршунова Л. Г. "Трансгенез у перепелов"
 Выдержки из автореферата диссертации на соискание ученой
степени доктора биологических наук, Москва, 2012
1. Общая характеристика работы
2. Материал и методы исследований
3. Результаты исследований
Выводы
Сведения о практическом использовании результатов исследований
Рекомендации по использованию научных выводов
Список работ, опубликованных по теме диссертации
3. Результаты исследований
Получение и фенотип трансгенных перепелов по гену
гормона роста быка
Перепела, трансгенные по гену гормона роста быка, были
получены хирургическим методом микроинъекции экзогенной
ДНК перепелиных яйцеклеток, как овулировавших, так и
находившихся на поздних стадиях созревания (крупные
фолликулы). Для инъекции использовали генную конструкцию
pMTbGH(2*att), содержащую природный ген гормона роста
быка (bGH gene), находящийся под контролем
металлотионинового промотора (MT prom) (рис. 1).
Последний активируется ионами цинка и других тяжелых
металлов, содержащихся в организме птицы. Активный
промотор заставляет экспрессироваться ген бычьего
гормона роста. У трансгенных по этой конструкции
перепелов происходит синтез указанного гормона.
Рисунок 1. Физическая карта плазмиды
pMTbGH(2*att) (указаны сайты рестрикции эндонуклеазами),
использованной в качестве генной конструкции при
получении генетически модифицированных перепелов
Было прооперировано 93 перепелки, у которых инъецировано
280 яйцеклеток, как овулировавших, так и находившихся в
крупных фолликулах. От них получено 122 перепеленка.
Методами блот-гибридизационного анализа и ПЦР было
исследовано 180 проб ДНК, выделенных из эмбрионов,
органов и тканей экспериментальных перепелов.
Нуклеотидные последовательности гена гормона роста быка
были обнаружены в ДНК 10 эмбрионов и 14 особей
перепелов. Распределение трансгена в тканях опытных
перепелов проиллюстрировано на рис. 2.
Трансгенные перепела были исследованы на содержание в
крови бычьего соматотропина. В некоторых образцах крови
он был обнаружен в количестве 1,0-3,0 нг/мл. Таким
образом, экспрессия трансгена в крови полученных
трансгенных перепелов составила от 1,0 до 3,0 нг/мл
бычьего соматотропина, тогда как в крови перепелов
контрольной группы искомый белок отсутствовал.
Трансгенность перепелов проявилась в ряду поколений.
Рисунок 2. Блот-гибридизационный
анализ ДНК из различных тканей перепелов: 1 - птица 116,
грудная мышца; 2 - птица 116, печень; 3 - птица 116,
ножная мышца; 4 - птица 22, миокард; 5 - птица 22,
грудная мышца; 6 - птица 107, грудная мышца; 7 - птица
107, миокард; 8 - кровь контрольного перепела плюс
плазмида в количестве 1-2 копии на гаплоидный геном
В процессе выращивания экспериментально полученных
перепелов и отвода от них потомства было замечено, что
некоторые самки сносили крупные яйца (14,0-21,0 г), а из
яиц с обычной массой вылуплялись перепелята с живой
массой на 15-25% выше обычной. Вскрытие показало, что
яйца не были двухжелтковыми и были покрыты нормально
пигментированной прочной скорлупой. Была установлена
связь признака «крупнояичности» с трансгенностью особей,
а также наследование этого признака (рис. 3).
Рисунок 3. Пример фенотипического
проявления трансгенности в потомстве перепелов
Это послужило основанием для размножения
экспериментальных особей и изучения фенотипа полученной
птицы. Трансгенные особи были использованы с целью
получения потомства для формирования и дальнейшего
исследования опытной группы перепелов. В настоящее время
получено и изучено 33 поколения экспериментальных
перепелов.
У трансгенных перепелов живая масса на 5-15% была выше,
чем в контроле. У их потомков сохранялось превосходство
по живой массе (рис. 4), причем у самок различия
оказались более существенны. В суточном и 1-недельном
возрасте опытные птицы были крупнее контрольных
соответственно на 21 и 13%. Средняя масса суточных
перепелят в опытной группе составляла 9,1, в контрольной
- 7,4 г. В 7- и 20-недельном возрасте статистически
достоверные различия наблюдались только у самок -
соответственно 8,0 и 6,0% (p<0,001).
Масса суточного молодняка птицы в значительной степени
обусловлена массой инкубационных яиц. В наших опытах с
увеличением массы яиц пропорционально увеличивалась
масса трансгенных суточных перепелят (r = +0,810). При
этом все перепелята были подвижными, активно реагировали
на звук, имели мягкий подобранный живот, чистую клоаку.
Пух мягкий, ровный, блестящий, правильно
пигментированный (коричневого цвета с двумя светлыми
полосками на спинке). Ноги и клюв крепкие, глаза
блестящие. Взрослые особи внешне не отличались от
контрольных перепелов.
Рисунок 4. Живая масса перепелов
опытной и контрольной групп, в среднем по 15 поколениям
Живая масса трансгенных перепелов варьировала от
поколения к поколению, однако, линия тренда для этого
показателя в 20-недельном возрасте свидетельствовала об
отсутствии тенденции к снижению (наклон незначительный,
R2 = 0,019) (рис. 5).
Рисунок 5. Живая масса самок
перепелов в возрасте 20 нед, трансгенных по гену бычьего
соматотропина, в разных поколениях.
Гормональный статус трансгенных перепелов по изученным
показателям не претерпел существенных изменений по
сравнению с контрольными. Среднее значение уровня
инсулина у самок опытной группы составило 15,8 и у
самцов -16,4 против 10,7 и 16,5 мкЕд/мл соответственно у
контрольной группы. Индивидуальные значения этого
показателя варьировали у опытной группы от 6,7 до 30,9 и
у контрольной - от 7,8 до 18,1 мкЕд/мл.
В значениях показателей содержания тиреоидных гормонов в
крови перепелов опытной и контрольной групп наблюдался
большой разброс. Так, минимальные концентрации тироксина
составляли 12 нМ, максимальные: 10-12 нМ. Средние
значения составили у опытных самок 4,2 и у самцов 6,1
нМ, тогда как у контрольных соответственно 4,7 и 5,7 нМ.
Концентрация трийодтиронина у опытных самок была 0,7 и у
самцов 1,6 нМ, у контрольных соответственно 0,8 и 1,6
нМ. Значительные колебания концентрации трийодтиро-нина
были более характерны для самок - от 0,2 до 2,1 нМ, в то
время как у самцов - от 1,2 до 2,1 нМ.
Показатель отношения концентрации инсулина к
трийодтиронину, по которому можно судить о сдвиге
метаболизма в организме, был выше у самок, чем у самцов,
а также у самок опытной группы по сравнению с
контрольной, что подтверждает более высокий уровень
анаболизма у подопытных самок, выраженный в повышенном
синтезе компонентов яйца.
Полученные данные по нарастанию титров антител в крови и
желтке яиц в ответ на введение антигена свидетельствуют
о повышении иммунного статуса у перепелов опытной
группы, выраженным в ускоренной выработке антител к
вводимому антигену. Через четыре недели титры антител у
опытных перепелов были выше (p<0,001), чем в контроле
(табл. 1). Достоверные различия были получены и для
экстрактов желтков яиц контрольной и опытной групп,
снесенных через 4 недели после вакцинации (p<0,001).
У трансгенных перепелов и их потомков масса яиц была на
10-20% выше, чем в контроле (p<0,001). На пике
продуктивности масса яиц у опытных перепелов в среднем
по 33 поколениям составила 13,0 г. Разброс показателя по
отдельным особям был от 11,3 до 15,0 г.
Яйценоскость перепелок в опытной группе в поколениях
колебалась от 200 до 235 яиц, в контроле - от 193 до 227
яиц за 10 месяцев продуктивного периода. Средняя
яйцемасса за этот период в опытной группе составила
2749,4 г, что на 11% больше, чем в контрольной группе (p<0,001).
Средняя число яиц и их масса по поколениям представлены
на диаграмме (рис. 6).
Рисунок 6. Число (1, 2) и масса (3,
4) яиц в среднем по 19-33 поколениям, 1, 3 - трансгенная,
2, 4 - интактная птица
В опытной и контрольной группе увеличение массы яйца до
14,0 г было обусловлено пропорциональным увеличением
массы его составных частей - скорлупы, белка, желтка.
При этом доля желтка составила 29-33%, белка - 58-61%,
скорлупы - 9-10%. Начиная с массы яиц выше 14 г в
опытной группе, соотношение составных частей изменилось.
Доля желтка возросла до 39,6%, белка - снизилась до
52,3% и скорлупы - до 8,1%. Индекс формы яиц массой от
8,0 до 14,0 г в контрольной и опытной группах варьировал
в пределах 75,483,6%. При дальнейшем увеличении массы
яиц в опытной группе происходило снижение индекса формы
до 67,5%, то есть форма становилась более вытянутой.
Большая часть сухих веществ желтка перепелиных яиц
приходится на долю липидов. В желтке яиц опытной группы
их содержалось от 26,1 до 29,3%, контрольной -
27,8-29,2%.
Содержание протеинов составило от 15,1 до 17,0% для всех
проанализированных желтков, независимо от их массы и
принадлежности к группе. Не установлено в обеих группах
закономерных различий и по содержанию воды в желтках яиц
разной массы.
Белок перепелиных яиц содержал 85,0-87,9% воды. На долю
протеинов приходилось от 8,9 до 10,9%. Закономерные
различия между группами также отсутствовали.
Содержание каротиноидов в желтке яиц опытной группы было
от 9,2 до 16,6 мкг/г, в контрольной - от 12,2 до 20,7
мкг/г. Отмечена тенденция повышения содержания
каротиноидов с увеличением массы яйца. Содержание
витамина А в желтке яиц опытной группы менялось от 12,8
до 16,8 мкг/г, в контрольной - от 14,2 до 19,7 мкг/г.
Содержание витамина Е в желтке яиц опытной группы
варьировало в пределах 56,7-80,5 мкг/г, в контрольной -
от 75,4 до 90,5 мкг/г. Витамина В2 в желтке яиц опытной
группы содержалось 3,68-4,10 мкг/г, контрольной -
3,82-4,42 мкг/г и не зависело от массы яиц. Витамин В2 в
белке яиц опытной группы находилось в пределах 1,681,91
мкг/г, контрольной - 1,95-2,16 мкг/г. Аминокислотный
состав яичного белка трансгенных перепелок не отличался
от такового у контрольных особей.
В желтках яиц у контрольных перепелок на долю насыщенных
жирных кислот приходилось 41,35, мононенасыщенных -
41,06, полиненасыщенных - 17,59%. Сумма насыщенных и
полин енасыщен-ных жирных кислот в липидах желтка у птиц
в опытной группе была несколько больше и составляла
соответственно 42,08 и 19,41%, сумма мононенасыщенных
жирных кислот была меньше, чем в контрольной - 38,51%.
Выявленные различия обусловлены в основном увеличением
содержания стеариновой и линолевой кислот на 1,8% и
уменьшением количества олеиновой кислоты на 2,3% в яйцах
у перепелок из опытной группы. При этом массовая доля
олеиновой кислоты изменялась от 31,40 до 37,00%,
линолевой - от 19,90 до 17,30%. В опытной группе
содержание стеариновой кислоты в яйцах у несушек 3- и
6-месячного возраста было соответственно 17,03 и 16,76%,
линолевой кислоты - 18,08 и 19,33%. Доля олеиновой
кислоты в яйцах несушек из опытной группы оказалась
38,55 и 33,59% соответственно. Следовательно, при
изменении массы яйца и в опытной, и контрольной группах
перепелок наблюдались колебания в содержании отдельных
жирных кислот в липидах желтка. Главным образом это
относилось к жирным кислотам с 18 атомами углерода:
стеариновой, олеиновой, линолевой и линоленовой.
Таким образом, в наших исследованиях экспериментально
показано, что у полученных трансгенных по гену гормона
роста быка перепелов произошло усиление биосинтетических
процессов в организме без изменений в биологических
закономерностях, определяющих процессы роста и развития
птицы, формирования яйца. Полученные данные
свидетельствуют о возможном практическом использовании
методов трансгенеза в селекционной работе на повышение
продуктивных показателей птицы.
|
Идёт загрузка...