Методические подходы к определению видовой специфичности мясной продукции
 Идентификация
ДНК животного происхождения необходима для выявления фальсификации мясной
продукции. Разработка методов контроля безопасности и качества мясной продукции
включает унификацию и апробацию методов, позволяющих идентифицировать ее видовую
специфичность.
В качестве быстрого и достоверного метода видового определения мясной продукции
предложена ПЦР, позволяющая получать воспроизводимые результаты высокой степени
точности. Принцип метода состоит в многократном увеличении концентрации
специфичного для данного вида животного участка ДНК с помощью специально
подобранной пары праймеров. В качестве матрицы для реакции используют фрагменты
генов митохондриальной или ядерной ДНК, являющиеся, как правило, строго
специфичными для каждого вида животного: 12S рРНК, Д-петля, 16S рРНК, цитохром
Б, тРНК Вал. По сравнению с альтернативными аналитическими методами,
основанными, например, на идентификации белка, ПЦР имеет существенное
преимущество: молекула ДНК является достаточно стабильной и это позволяет
проводить достоверное определение даже в продуктах, подвергшихся существенной
термической обработке.
Методом ПЦР с использованием видоспецифичной пары праймеров на перепела нами
было определено наличие или отсутствие перепелиных яиц в 12 образцах майонезов.
Предварительно пара праймеров была проверена на возможность возникновения
перекрестной реакции с пятью различными стандартами ДНК животного происхождения:
курица, перепел, утка, индейка, говядина. Праймеры на перепела показали
достоверную видоспецифичность.
Для идентификации был применен метод Nested ПЦР, который позволяет повысить
чувствительность реакции и избежать появления нежелательных побочных продуктов.
Метод основан на последовательном применении двух пар праймеров - внешней и
внутренней. После проведения первого раунда продуктом амплификации является
достаточно большой фрагмент гена 12S рРНК, составляющий 720 пар нуклеотидов,
присутствующий в митохондриальном геноме следующих видов птиц: перепел, фазан,
куропатка, цесарка, глухарь, вальдшнеп, вяхирь, певчий дрозд, курица, индейка,
гусь, мускусная утка.
Для следующего этапа идентификации использовалась вторая пара праймеров,
видоспецифичная на перепела, которая комплементарно связывалась с внутренним
фрагментом ампликона, полученного после первого раунда ПЦР. Результатом
амплификации являлась нуклеотидная последовательность в 129 пар азотистых
оснований, регистрируемая методом горизонтального электрофореза.
Дополнительно в качестве внутреннего контроля была использована еще одна пара
праймеров, комплементарно связывающаяся с фрагментом гена, кодирующего 18S рРНК,
длиною 89 пар нуклеотидов. Этот ген является общим для млекопитающих и птиц.
Таким образом, во втором раунде проводили дюплексную ПЦР: одновременно в
реакционную смесь вводили праймеры внутреннего контроля и видоспецифичные для
перепела. Одновременное присутствие в ультрафиолетовом свете 2 полос свечения на
уровне 129 и 89 пар нуклеотидов позволяло достоверно утверждать о наличии в
составе майонеза перепелиного яйца.
Наряду с классическим вариантом ПЦР для определения видовой специфичности
используется метод «SureFood® Animal-ID», представляющий собой комплекс
PCR-ELISE и иммуноферментной детекции. Коммерческие наборы с помощью
видоспецифичных зондов позволяют определить наличие в образце ДНК следующих
животных: коровы, козы, свиньи, овцы, оленя, курицы, гуся, индейки и утки.
Методом «SureFood® Animal-ID» были проведены исследования 17 образцов мясной
продукции, содержащей в своем составе свинину, курицу, баранину, индейку,
говядину, утку, среди которых 9 являлись многокомпонентными продуктами:
сырокопченые и вареные колбасы, мясные нарезки, сосиски, а также брынза.
Результаты выявили высокую чувствительность метода (предел обнаружения составил
не менее 1%) и высокую специфичность зондов, которая дает возможность
достоверной идентификации ДНК нескольких видов животных в многокомпонентных
образцах, прошедших глубокую термическую обработку.
В дальнейшем в рамках данной работы планируется разработать, унифицировать и
апробировать методы контроля мясной продукции, основанные на видовом определении
ДНК животного происхождения.
Устинова Ю.В., Песчаницкая Е.В.
Московский государственный университет пищевых производств
|
Идёт загрузка...